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Ki67蛋白是细胞周期相关的一种核蛋白，主要表达于细胞增殖分裂的各个时期(G1、S、G2和M期)，但是在静息的细胞(G0期)中不表达。Ki67常用于检测肿瘤细胞的生长指数(免疫组化法利用计算细胞总数中的Ki67阳性细胞数所占比例得到Ki67指数)。

微量移液器、低速离心机、平板摇床、微量移液器、光学显微镜、1.5mL离心管、4%多聚甲醛、去离子水、PBS、30%过氧化氢溶液、二甲苯、甲醇、乙醇、苏木素染色液、BSA、封片胶。

1. 本试剂盒的检测依赖于抗体免疫组化反应，样本操作过程中注意切勿干片，DAB显色液注意避光。
   
2. 为保证您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 梯度酒精溶液：50%、70%、80%、90%、95%、100%。
   
2. 细胞通透液：0.01mL Trition X-100加到9.99mL ddH2O中。
   
3. 抗体稀释液：0.1mg BSA溶于10mL PBS。
   
4. 抗原修复液：0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH6.0(可选，石蜡包埋的切片组织适用)
   
5. 内源性HRP酶灭活液：3% H2O2-甲醇。

1. 细胞样本：
   
   1. 细胞固定：将爬有细胞的盖玻片用PBS洗两遍，然后加入4%的多聚甲醛固定1-2h。
      
   2. 水化：将固定好的细胞爬片加几滴PBS覆盖15min，然后用PBS洗三遍。
      
   3. 通透：在爬片上加细胞通透液(0.1% Triton -X)，冰上放置5min。
      
   4. 洗涤：以洗涤液浸泡5min，清洗3次。
2. 组织样本：
   
   1. 预处理：在脱蜡之前，将切片60℃恒温箱中烘烤60min。
      
   2. 脱蜡：将切片用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min。
      
   3. 水化：分别用无水乙醇中浸泡5min；95%乙醇中浸泡5min；85%乙醇中浸泡5min；70%乙醇中浸泡5min。
      
   4. 洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次。
      
   5. 抗原修复：将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的烧杯中，高火档至煮沸，将烧杯取出置于电热器上保持微沸状态20min，而后将烧杯浸入流水中(不可将玻片从缓冲液中取出冷却)，自然冷却。
      
   6. 洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次。

1. 内源性HRP酶灭活：滴加过氧化氢工作溶液覆盖样本，冰上放置5～10min。
   
   过氧化氢工作溶液以双蒸水十倍稀释10×过氧化氢溶液即为过氧化氢工作溶液，临用前现用现配。
   
   
2. 洗涤：PBS浸泡2min，清洗3次。
   
3. 封闭：每片滴加50μL的即用型山羊血清封闭液，放入湿盒中，37℃孵育10min后，再以洗涤液浸泡2min，清洗3次。
   
4. 一抗孵育：以预先配制好的抗体稀释液稀释一抗，现用现配。加入一抗(Ki67建议稀释比例1:50～1:100)50～100μL，放入湿盒，37℃孵育1h。
   
5. 洗涤：以PBS浸泡2min，清洗3次。
   
6. 二抗孵育：滴加50μL即用型HRP标记羊抗兔IgG覆盖样本，放入湿盒，37℃孵育10min。
   
7. 洗涤：PBS浸泡2min，清洗5次。
   
8. DAB法显色：制备DAB显色液(现用现配，参见附表1)，每片加一滴，室温显色2～5min。
   
9. 终止显色：镜下观察染色深浅，染好立即中止，用自来水轻柔冲洗15min用蒸馏水终止显色反应。
   
10. 复染：将切片放入苏木素染液，染色5min，用蒸馏水冲洗干净。
    
11. 封片：1%盐酸酒精分化20s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%酒精浸泡5min；85%乙醇中浸泡5min；95%乙醇中浸泡5min；无水乙醇中浸泡5min。用二甲苯浸泡5min，更换二甲苯后再浸泡5min。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。
    
12. 观察：光学显微镜检测，拍照。