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Ki-67蛋白是细胞周期相关的一种核蛋白，主要表达于细胞增殖分裂的各个时期(G1、S、G2和M期)，但是在静息的细胞(G0期)中不表达。Ki-67常用于检测肿瘤细胞的生长指数(免疫组化法利用计算细胞总数中的Ki-67阳性细胞数所占比例得到Ki-67指数)。

1. 仪器：微量移液器、低速离心机、平板摇床、微量移液器、光学显微镜、1.5m L Micro-tube。
   
2. 试剂：4%多聚甲醛、去离子水、PBS(10mM,pH7.4)、二甲苯、乙醇、苏木素染液、BSA、封片胶。

1. 梯度酒精溶液：50%～70%～80%～90%～95%～100%
   
2. 细胞通透液0.1% Trition X-100：0.01mL Trition X-100加到9.99mL dH2O中
   
3. 抗体稀释液PBS-1% BSA：0.1mg BSA溶于10mL PBS
   
4. 抗原修复液(石蜡包埋的切片组织适用)：0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH6.0(可选)

1. 细胞样本
   
   1. 细胞固定：将爬有细胞的盖玻片用PBS洗两遍，然后加入4%的多聚甲醛固定1h-2h。
      
   2. 水化：将固定好的细胞爬片加几滴PBS覆盖15分钟，然后用PBS洗三遍。
      
   3. 通透：在爬片上加细胞通透液(0.1% Triton -X)，冰上放置5分钟。
      
   4. 洗涤：以洗涤液浸泡5分钟，清洗3次。
2. 组织样本
   
   1. 预处理：在脱蜡之前，将切片60℃恒温箱中烘烤60分钟。
      
   2. 脱蜡：将切片用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。
      
   3. 水化：分别用无水乙醇中浸泡5分钟；95%乙醇中浸泡5分钟；85%乙醇中浸泡5分钟；70%乙醇中浸泡5分钟。
      
   4. 洗涤：PBS浸泡5分钟，清洗3次。
      
   5. 抗原修复：将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的烧杯中，高火档至煮沸，将烧杯取出置于电热器上保持微沸状态20分钟，而后将烧杯浸入流水中(不可将玻片从缓冲液中取出冷却)，自然冷却。
      
   6. 洗涤：PBS浸泡5分钟，清洗3次。
3. 免疫反应检测
   
   1. 内源性HRP酶灭活：滴加过氧化氢工作溶液(以双蒸水十倍稀释10×过氧化氢溶液即为过氧化氢工作溶液，临用前现用现配)覆盖样本，冰上放置5～10分钟。
      
   2. 洗涤：PBS浸泡2分钟，清洗3次。
      
   3. 封闭：每片滴加50μL的即用型山羊血清封闭液，37℃湿盒孵育10分钟后，再以洗涤液浸泡2分钟，清洗3次。
      
   4. 一抗孵育：以预先配置好的抗体稀释液稀释一抗，现用现配。加入一抗(Ki-67建议稀释比例1：50)100μL，37℃，湿盒孵育1小时。
      
   5. 洗涤：以PBS浸泡2分钟，清洗3次。
      
   6. 二抗孵育：滴加50μL即用型HRP标记羊抗兔IgG覆盖样本，37℃湿盒孵育10分钟。
      
   7. 洗涤：PBS浸泡2分钟，清洗5次。
      
   8. DAB法显色：制备DAB显色液(现用现配，参见附表1)，每片加一滴，室温显色2～5min。
      
   9. 终止显色：镜下观察染色深浅，染好立即中止，用自来水轻柔冲洗15分钟用蒸馏水终止显色反应。
      
   10. 复染：将切片放入苏木素染液，染色5min，用蒸馏水冲洗干净。
       
   11. 封片：1%盐酸酒精分化20秒，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%酒精浸泡5分钟；85%乙醇中浸泡5分钟；95%乙醇中浸泡5分钟；无水乙醇乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡5分钟，更换二甲苯后再浸泡5分钟。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。
       
   12. 观察：光学显微镜检测，拍照。